Clinical implementation of comprehending dentin on a microscopic level

SUMMARY: The aim of the present in vitro study is to visualize dentin to get an in-depth knowledge of the nature of dentin that could provide useful information regarding conditioning dentinal substrate when treating dentinal lesions. Forty-nine extracted human third molars were obtained and prepared to produce artificial dentinal lesions through demineralizing with acetic acid for 7 and 14 days, or lactic acid for 7 days. The teeth were divided into groups and treated with either NaOCl, pepsin, trypsin, or phosphoric acid. To obtain information on the morphology of the treated dentinal surfaces, all samples were visualized under high resolution field emission scanning electron microscope. With high magnification reaching x50000 dentin was clearly visualized together with its constitutes. The effect of various demineralization approaches and various treatment protocols were demonstrated clearly. The relationship between the conditioning procedure steps and the subsequent bond strength was discussed. To our best knowledge, there is no previous clear highly magnified scanning electron microscope images for dentin, and dentinal components and constitutes with and without various treatments. The current in vitro study suggests the complexity nature of dentin as a substrate that should be treated carefully especially with technique sensitive procedures such as adhesive restorations.

El objetivo del presente estudio in vitro fue visualizar la dentina para obtener un conocimiento completo de la naturaleza de ella lo que podría proporcionar información útil sobre el acondicionamiento del sustrato dentinario en el tratamiento de lesiones dentinarias. Se obtuvieron 49 terceros molares humanos extraídos y se prepararon para producir lesiones dentinales artificiales mediante desmineralización con ácido acético por 7 y 14 días, o ácido láctico por 7 días. Los dientes se dividieron en grupos y se trataron con NaOCl, pepsina, tripsina o ácido fosfórico. Para obtener información sobre la morfología de las superficies dentinarias tratadas, todas las muestras se visualizaron bajo un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo de alta resolución. Con un gran aumento que alcanzó x50000, la dentina se visualizó claramente junto con sus componentes. Se demostró el efecto de varios enfoques de desmineralización y varios protocolos de tratamiento. Se discutió la relación entre los pasos del procedimiento de acondicionamiento y la subsiguiente fuerza de unión. Hasta donde sabemos, no hay imágenes claras previas de microscopio electrónico de barrido altamente ampliadas para la dentina y los componentes y constituyentes de la dentina con y sin diferentes tratamientos. El estudio in vitro actual sugiere la naturaleza compleja de la dentina como sustrato que debe tratarse con cuidado, especialmente en los procedimientos sensibles a la técnica, tal como las restauraciones adhesivas.

Energy values and protein digestibility of soybean milk by-product in pigs based on in vitro assays / Valores energéticos y digestibilidad proteica del subproducto de la leche de soja en cerdos con base en ensayos in vitro / Valores energéticos e digestibilidade protéica do subproduto do leite de soja em suínos com base em ensaios in vitro

Abstract Background: Soybean milk by-product (SMBP) is a potential alternative feed ingredient in swine diets due to its high protein content. However, information on energy and nutritional values of SMBP used as swine feed ingredient is limited. Objective: To estimate energy values and protein digestibility of SMBP in pigs based on in vitro assays. Methods: Four SMBP samples were obtained from 3 soybean milk-producing facilities. In vitro total tract disappearance (IVTTD) and in vitro ileal disappearance (IVID) of dry matter (DM) in the SMBP samples were determined. In vitro ileal disappearance of crude protein was determined by analyzing crude protein content in undigested residues after determining IVID of DM. Digestible and metabolizable energy of SMBP were estimated using gross energy, IVTTD of DM, and prediction equations. Results: Sample 4 had greater IVTTD of DM than that of sample 3 (97.7 vs. 94.4%, p<0.05), whereas IVID of DM in sample 4 was lower compared with sample 1 (53.5 vs. 65.0%, p<0.05). In vitro ileal disappearance of crude protein in sample 2 was greater than that in sample 1 and 3 (92.6 vs. 90.6 and 90.1%; p<0.05). The estimated metabolizable energy of SMBP ranged from 4,311 to 4,619 kcal/kg as-is basis and the value of sample 3 was the least (p<0.05) among SMBP samples. Conclusion: Energy values and protein digestibility should be determined before using SMBP in swine diets.

Resumen Antecedentes: El subproducto de la leche de soja (SMBP) es un ingrediente alimenticio alternativo con uso potencial en dietas porcinas dado su alto contenido de proteína. Sin embargo, la información sobre sus valores energéticos y nutricionales para alimentación de cerdos es muy limitada. Objetivo: Estimar los valores de energía y la digestibilidad de la proteína del SMBP en cerdos con base en ensayos in vitro. Métodos: Se obtuvieron cuatro muestras de SMBP de tres empresas productoras de leche de soja. Se determinaron la desaparición de tracto total in vitro (IVTTD) y la desaparición ileal in vitro (IVID) de la materia seca (DM) en las muestras de SMBP. La desaparición ileal in vitro de proteína cruda se determinó analizando el contenido de proteína cruda en residuos no digeridos después de determinar la IVID de la DM. La energía digestible y metabolizable de SMBP se estimó utilizando la energía bruta, IVTTD de la DM y ecuaciones de predicción. Resultados: La muestra 4 tuvo una mayor IVTTD de la DM que la muestra 3 (97,7 vs. 94,4%, p<0,05), mientras que la IVID de la DM en la muestra 4 fue menor en comparación con la muestra 1 (53,5 vs. 65,0%, p<0,05). La desaparición ileal in vitro de la proteína cruda en la muestra 2 fue mayor que la de las muestras 1 y 3 (92,6 vs. 90,6 y 90,1%; p<0,05). La energía metabolizable estimada de SMBP varió de 4.311 a 4.619 kcal/kg (en base húmeda) y el valor de la muestra 3 fue el menor (p<0.05) entre las muestras de SMBP. Conclusión: Los valores de energía y la digestibilidad de la proteína deben determinarse antes de usar el SMBP en dietas porcinas.

Resumo Antecedentes: O subproduto do leite de soja (SMBP) é um potencial ingrediente alternativo na dieta de suínos, considerando seu alto teor de proteínas. No entanto, as informações sobre os valores energéticos e nutricionais do SMBP usado como ingrediente alimentar para suínos são limitadas. Objetivo: Estimar valores energéticos e digestibilidade protéica do SMBP em suínos com base em ensaios in vitro. Métodos: Foram obtidas quatro amostras de SMBP de três instalações produtores de leite de soja. Foram determinados o desaparecimento total do trato in vitro (IVTTD) e o desaparecimento ileal in vitro (IVID) da matéria seca (DM) nas amostras de SMBP. O desaparecimento ileal in vitro da proteína bruta foi determinado pela análise do conteúdo de proteína bruta em resíduos não digeridos após a determinação da IVID do DM. A energia digerível e metabolizável do SMBP foi estimada usando energia bruta, IVTTD do DM e equações de predição. Resultados: a amostra 4 apresentou maior IVTTD de DM do que a amostra 3 (97,7 vs. 94,4%, p<0,05) enquanto a IVID do DM na amostra 4 foi menor em comparação com a amostra 1 (53,5 vs. 65,0%, p<0,05). O desaparecimento ileal in vitro da proteína bruta na amostra 2 foi superior ao da amostra 1 e 3 (92,6 vs. 90,6 e 90,1%; p<0,05). A energia metabolizável estimada do SMBP variou de 4.311 a 4.619 kcal/kg no estado em que se encontra e o valor da amostra 3 foi o menor (p<0,05) entre as amostras do SMBP. Conclusão: os valores energéticos e a digestibilidade das proteínas devem ser determinados antes do uso do SMBP nas dietas suínas.

Electrochemical analysis of the corrosion inhibition properties of L-leucine and trypsin complex admixture on high carbon steel in 1 M H 2 SO 4 solution / Análisis electroquímico de las propiedades de inhibición de la corrosión de la mezcla de L-leucina y complejo de tripsina sobre acero de alto contenido de carbono en solución 1 M de H 2 SO 4 / Análise eletroquímica das propriedades de inibição da corrosão da mistura de L-leucina e complexo de tripsina em aço de alto carbono em solução 1 M de H 2 SO 4

Abstract Corrosion inhibition of biodegradable chemical compounds (L-leucine and trypsin complex) on high carbon steel in 1 M H2SO4 acid media was evaluated with potentiodynamic polarization technique, weight loss analysis, open circuit potential measurement, optical microscopy, and ATR-FTIR spectroscopy. Data obtained showed the mixture has a maximum inhibition efficiency of 82.4% and 90.08% from the electrochemical tests with mixed type inhibition properties. The addition of the mixture shifts significantly the corrosion potential of the steel to passivation values from open circuit potential measurement. Results from thermodynamic calculations indicated chemisorption adsorption mechanism according to Langmuir, Freundlich, and Frumkin isotherms coupled with correlation coefficients of 0.9994, 0.9651 and 0.8834. Statistical analysis showed exposure time to be the most significant variable responsible for corrosion inhibition. Identified functional groups of the compound from ATF-FTIR spectroscopy were adsorbed completely on the carbon steel surface from observation of the decreased peak intensity. Optical microscopy images of the inhibited and uninhibited steel surfaces contrast each other with due to the presence of macro-pits and porous oxide on the uninhibited steel.

Resumen Se evaluó la inhibición de la corrosión por parte de compuestos químicos biodegradables (complejo de L-leucina y tripsina) sobre acero de alto contenido de carbono en H2SO4 1 M a través de técnica de polarización potenciodinámica, análisis de pérdida de peso, medición de potencial de circuito abierto, microscopía óptica y espectroscopia ATR-FTIR. Los datos obtenidos mostraron que la mezcla tiene una eficacia de inhibición máxima de 82,4% y 90,08%, a partir de las pruebas electroquímicas con propiedades de inhibición de tipo mixto. La adición de la mezcla cambia significativamente el potencial de corrosión del acero a los valores de pasivación de la medición del potencial de circuito abierto. Los resultados de los cálculos termodinámicos indicaron un mecanismo de adsorción por quimisorción de acuerdo con las isotermas Langmuir, Freundlich y Frumkin, acopladas con coeficientes de correlación de 0,9994; 0,9651 y 0,8834, respectivamente. El análisis estadístico mostró que el tiempo de exposición es la variable más importante en la inhibición de la corrosión. Los grupos funcionales de la mezcla, identificados mediante espectroscopía ATF-FTIR, fueron completamente adsorbidos en la superficie de acero al carbono; esto se dedujo a partir de la observación de la disminución de la intensidad de pico. Las imágenes de microscopía óptica de las superficies de acero inhibidas y desinhibidas contrastan entre sí, debido a la presencia de macro-pozos y óxido poroso en el acero desinhibido.

Resumo Foram feitos estudos de inibição da corrosão de compostos químicos biodegradáveis ccomplexo de L-leucina e tripsina) em aço de alto conteúdo de carbono em meio de H2SO4 1 M, estes foram avaliados com técnica de polarização potenciodinâmica, análise de perda de peso, medição de potencial de circuito aberto, microscopia óptica e espectroscopia ATR-FTIR. Os dados obtidos mostram que a mistura tem uma eficiência de inibição máxima de 82,4% e 90,08% dos testes eletroquímicos com propriedades de inibição do tipo misto. A adição da mistura desloca significativamente o potencial de corrosão do aço para valores de passivação da medição de potencial de circuito aberto. Os resultados dos cálculos termodinâmicos indicam o mecanismo de adsorção de quimisorção de acordo com as isotermas de Langmuir, Freundlich e Frumkin, juntamente com coeficientes de correlação de 0,9994; 0,9651 e 0,8834 respectivamente. A análise estatística mostrou que o tempo de exposição é a variável mais significativa da inibição da corrosão. Os grupos funcionais identificados pela espectroscopia ATF-FTIR foram completamente adsorvidos na superfície do aço ao carbono, de acordo com a observação da intensidade de pico diminuída. As imagens de microscopia óptica das superfícies de aço inibidas e desinibidas contrastam entre si devido à presença de macro-poços e óxido poroso no aço desinibido.

Characterization of digestive enzymes from captive Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus / Caracterização de enzimas digestivas do linguado brasileiro de cativeiro Paralichthys orbignyanus

Abstract Knowledge of specific enzyme activity, along with animal habits and digestive capacity is essential in formulating an appropriate diet for any species. In this study, we evaluated and characterized the activity of digestive enzymes present in the liver, intestine, and stomach of Paralichthys orbignyanus. The effects of pH and temperature on enzyme activity were also evaluated via the use of specific substrates. The use of specific substrates and inhibitors showed strong evidence of the presence of trypsin (BApNA= 0.51 ± 0.2 mU mg-1), chimotrypsin (SApNA= 2.62 ± 1.8 mU mg-1), and aminopeptidases (Leu-p-Nan =0.9709 ± 0.83 mU mg-1) in the intestine. Optimum pH for the activity of trypsin, chemotrypsin, leucino aminopeptidase, amilase, and pepsin were 9.5, 9.0, 8.0, 7.5, and 3.5, respectively, while optimum temperatures were 50, 50, 50, 40, and 45 °C, respectively. These results provide additional information regarding the biology of Brazilian flounder and can be used as a basis for further studies regarding fish feeding physiology.

Resumo O conhecimento da atividade enzimática é essencial para formular uma correta dieta específica para espécie, além de estarem correlacionadas com o hábito da alimentação e capacidade digestive. Neste estudo determinamos e caracterizamos a atividade enzimática presente no intestino, estômago e fígado do linguado Paralichthys orbignyanus. Os efeitos da temperatura e pH sobre a atividade enzimática também foram avaliados utilizando substratos específicos. O uso de substratos e inibidores específicos mostrou uma forte evidência da presença da tripsina (BApNA = 0,51 ± 0,2 mU mg-1), quimotripsina (SAPNA = 2,62 ± 1,8 mU mg-1), e as aminopeptidases (Leu-p-Nan = 0,97 ± 0,83 mU mg-1) no intestino. O pH ótimo observado para a atividade de tripsina, quimotripsina, leucino aminopeptidase, amilase e pepsina foi 9,5, 9,0, 8,0, 7,5 e 3,5, respectivamente. A temperatura ótima observada foi 50, 50, 50, 40 e 45 °C, respectivamente. Estes resultados fornecem informações adicionais sobre a biologia do linguado brasileiro e pode ser usado como base para novos estudos sobre fisiologia alimentar.

Avances en el conocimiento de las proteínas de la leche materna / Advances in the knowledge about human milk proteins

La glándula mamaria y la leche materna son el resultado de millones de años de una evolución que llevó a una composición óptima para el crecimiento y desarrollo de recién nacidos y lactantes; la leche materna favorece el crecimiento, la adaptación y la supervivencia de su organismo y de sus órganos inmaduros. Análisis recientes han demostrado en ella la presencia de 1606 proteínas que en su mayoría son sintetizadas en los acinos de la glándula mamaria aunque otras proteínas y péptidos provienen de órganos como el sistema linfático y el aparato digestivo. La composición de la leche materna incluye enzimas que modifican sus proteínas y originan péptidos antimicrobianos, antihipertensivos y estimuladores del metabolismo. Esta actividad proteolítica actúa en sitios específicos de las cadenas peptídicas de la proteína de la leche. La activación extemporánea de estos enzimas en los acinos es regulada por péptidos inhibidores y activadores que previenen procesos inflamatorios. Algunos enzimas de la leche actúan en el tubo digestivo de recién nacidos y lactantes y complemen tan la menor concentración y actividad de sus propios enzimas digestivos. Así, la enteroquinasa de la leche estimula la liberación de enzimas pancreáticos (mediada por el estímulo de la colecistoquinina-pancreozimina); la lipasa activada por las sales biliares complementa la baja producción de lipasa pancreática. Estas actividades probablemente facilitan la nutrición de los prematuros, cuyo tubo di gestivo es más permeable a las proteínas parcialmente hidrolizadas y cuyas actividades enzimáticas y factores defensivos locales no han alcanzado su plena madurez. Esto también puede estimular en ellos la tolerancia inmunológica. En este artículo se presentan los aspectos fisiológicos relevantes de la leche materna, y los avances en el conocimiento de su composición, para el cabal conocimiento del pediatra de esta importante materia.

The mammary gland and maternal milk are the product of millions of years of evolution that resul ted in an optimal composition that sustains the growth and development of newborns and infants. Maternal milk supports the growth, adaptation and survival of this immature organism. Recent studies have detected 1606 different proteins in human milk, most of them synthesized in the acini of the glandular tissue while others originate from distant organs such as the lymphoid tissue and the digestive tract. Maternal milk enzymes modify its proteins and liberate peptides with antimicrobial, antihypertensive or stimulatory activities. This proteolytic activity occurs at specific sites in peptide chains. To prevent the extemporaneous activation of these proteolytic enzymes, that would result in inflammatory processes, maternal milk also contains inhibitory peptides that together with the stimulatory peptides conform a complex regulatory system. Some enzymes in maternal milk main tain their activity in the gastrointestinal tract of infants and compensate for the decreased activity of digestive tract enzymes in newborns. Thus, the milk enterokynase stimulates the release of pancreatic proteases as it induces the liberation of cholecystokynin/pancreozymin. The bile salt-activated lipase of human milk is activated in the duodenum by the infants' bile salts and partially compensates for the low levels of pancreatic lipase in newborns. These milk enzymes probably contribute to the nutrition of premature infants as they increase the availability of amino acids and peptides in their upper gastrointestinal tract; furthermore, as their intestinal epithelium is more permeable to peptides and partially digested protein this may help induce immune tolerance. The most relevant issues in the physiology and composition of the maternal milk are presented in this review.

Resistance of maize cultivars to Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) / Resistência de cultivares de milho a Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae)

Five Zea mays cultivars (BRS Caatingueiro, BRS Gorutuba, BRS Sertanejo, BRS Asa Branca and BR 106) were evaluated considering their effect on the nutrition of the maize weevil Sitophilus zeamais, by analysis of total protein in adult fed with these cultivars and for the presence of lectins and trypsin inhibitors in grains. In addition, free-choice and no-choice assays were performed to investigate the resistance of grains of the Z. mays cultivars to an attack by S. zeamais. The BR 106 cultivar showed the lowest susceptibility index, followed by BRS Caatingueiro, BRS Asa Branca, BRS Sertanejo and BRS Gorutuba. The number of emerged adults in the Z. mays cultivars ranged from 213.17 to 74.0, and the lowest number of insects was recorded for the BR 106 cultivar. The insects were able to feed on grains of all cultivars, but the BR 106 cultivar showed the least reduction in dried biomass. Lectins were detected in extracts from BR 106, BRS Asa Branca, BRS Sertanejo and BRS Gorutuba, and the highest activity was shown by BR 106. The lowest protein assimilation was detected in the insects from treatments with BRS Asa Branca. The extracts from all cultivars were able to inhibit the activity of bovine trypsin, but this effect was not related to the resistance degree of Z. mays cultivars. The results suggest the resistance of BR 160 to the attack of S. zeamais, as well as indicating that the presence of lectin in the grains is the cause of this resistance.(AU)

Foram avaliadas cinco cultivares de Zea mays (BRS Caatingueiro, BRS Gorutuba, BRS Sertanejo, BRS Asa Branca e BR 106) e seu efeito na nutrição do gorgulho-do-milho Sitophilus zeamais, por meio da análise de proteína total em adultos alimentados com esses cultivares e a presença de lectinas e inibidores da tripsina nos grãos. Além disso, foram realizados ensaios com e sem chance de escolha para investigar a resistência dos cultivares de Z. mays ao ataque de S. zeamais. O cultivar BR 106 apresentou o menor índice de susceptibilidade, seguido por BRS Caatingueiro, BRS Asa Branca, BRS Sertanejo e BRS Gorutuba. O número de adultos emergidos nos cultivares de Z. mays variou de 213,17 a 74,0, e o menor número de insetos foi registrado para o cultivar BR 106. Os insetos foram capazes de se alimentar de todos os cultivares, no entanto, o BR 106 mostrou a menor redução na biomassa seca. As lectinas foram detectadas em extratos de BR 106, BRS Asa Branca, BRS Sertanejo e BRS Gorutuba, e a maior atividade foi demonstrada pela BR 106. A menor assimilação de proteína foi detectada nos insetos que se alimentaram com BRS Asa Branca. Os extratos de todos os cultivares foram capazes de inibir a atividade da tripsina bovina, mas esse efeito não está correlacionado ao grau de resistência dos cultivares de Z. mays. Os resultados sugerem a resistência da BR 160 ao ataque de S. zeamais, além de indicar que a presença de lectina nos grãos é a causa dessa resistência.(AU)

Composición química e indicadores de calidad del frijol de soya (Glycine max) integral procesado con vapor para la alimentación de aves y cerdos / Chemical composition and quality indicators of full-fat soybean steam processed for poultry and swine feeding

Este estudio se realizó para determinar la composición química e indicadores de calidad del frijol de soya (Glycine max) integral (FSI) procesado con vapor en un autoclave bajo condiciones estándares de trabajo a 2,30 bar de presión a 103°C/30 min. Se tomaron seis muestras después del procesamiento de cada uno de tres lotes de soya provenientes de Estados Unidos. Se obtuvo la media por lote y general para cada variable con el error estándar (± EE). Las medias generales de materia seca, proteína, grasa, fibra, ceniza, Ca y P (g/100 g) y energía bruta (kcal/kg) fueron 91,40±0,40; 36,82±0,18; 20,88±0,49; 6,69±0,21; 4,80±0,05; 0,30±0,06; 0,53±0,006 y 5732±44,14, respectivamente. Hubo variaciones entre lotes para materia seca, P (P<0,01), fibra, ceniza y energía bruta (P≤0,05). Se observó predominio de lisina, arginina y leucina cuyas medias generales fueron 2,26±0,01; 2,70±0,01 y 2,81±0,01, respectivamente. Los ácidos grasos predominantes fueron oleico y linoleico con medias generales (g/100g) de 21,65±0,12 y 51,07±0,13, respectivamente. Se observaron variaciones (P≤0,01) entre lotes en la acidez y en los índices de saponificación, yodo y acidez. Las medias generales para inhibidores de tripsina, solubilidad de la proteína en KOH, actividad de ureasa y lisina reactiva fueron 3,04 ± 0,36 mg/g de muestra; 80,29 ± 1,09%; 0,05 ± 0,01% y 1,87±0,06%, respectivamente. Aunque hubo variaciones entre lotes para algunos componentes e indicadores de calidad, el FSI procesado con vapor es una fuente proteica de buena calidad, con buen contenido de lisina, grasa, energía bruta y ácidos grasos esenciales para la alimentación de aves y cerdos(AU)

This study was conducted to determine the chemical composition and quality indicators of full-fat soybean (Glycine max) (FFSB) steam processed in an autoclave under standard contitions of work of 2.30 bar of pressure and 103°C/30 min. Six samples were taken after the processing of each of three soybean batches from the United States. The average was obtained by batch and overall for each variable with the standard error of the mean (± SEM). The total averages of dry matter, protein, fat, fiber, ash, Ca and P (g/100g) and gross energy (kcal/kg) were 91.40±0.40, 36.82 ± 0.18; 20.88±0.49, 6.69 ± 0.21, 4.80±0,05, 0.30±0.06, 0.53±0.006, and 5732±44.14, respectively. There were variations among batches for dry matter, P (P<0.01), fiber, ash and gross energy (P≤0.05). There was a predominance of lysine, arginine and leucine (g/100 g) with average of 2.26±0.01, 2.70±0.01 and 2.81±0.01, respectively. The predominant fatty acids (g/100 g) were oleic and linoleic with general averages of 21.65 ± 0.12 and 51.07 ± 0.13, respectively. There were variations (P≤0.01) among batches in acidity and saponification, iodine and acidity index. The average for trypsin inhibitors, protein solubility in KOH, urease activity and reactive lysine were 3.04 ± 0.36 mg/g of sample; 80.29 ± 1.09%, 0.05 ± 0.01% y 1.87±0.06%, respectively. Although there were variations among batches for some components and quaility indicators, the FFSB steam processed is a protein source of good quality with good content of lysine, fat, gross energy and essential fatty acids for feeding poultry and swine(AU)

Characterization of digestive enzymes from captive Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus

Abstract Knowledge of specific enzyme activity, along with animal habits and digestive capacity is essential in formulating an appropriate diet for any species. In this study, we evaluated and characterized the activity of digestive enzymes present in the liver, intestine, and stomach of Paralichthys orbignyanus. The effects of pH and temperature on enzyme activity were also evaluated via the use of specific substrates. The use of specific substrates and inhibitors showed strong evidence of the presence of trypsin (BApNA= 0.51 ± 0.2 mU mg-1), chimotrypsin (SApNA= 2.62 ± 1.8 mU mg-1), and aminopeptidases (Leu-p-Nan =0.9709 ± 0.83 mU mg-1) in the intestine. Optimum pH for the activity of trypsin, chemotrypsin, leucino aminopeptidase, amilase, and pepsin were 9.5, 9.0, 8.0, 7.5, and 3.5, respectively, while optimum temperatures were 50, 50, 50, 40, and 45 °C, respectively. These results provide additional information regarding the biology of Brazilian flounder and can be used as a basis for further studies regarding fish feeding physiology.

Resumo O conhecimento da atividade enzimática é essencial para formular uma correta dieta específica para espécie, além de estarem correlacionadas com o hábito da alimentação e capacidade digestive. Neste estudo determinamos e caracterizamos a atividade enzimática presente no intestino, estômago e fígado do linguado Paralichthys orbignyanus. Os efeitos da temperatura e pH sobre a atividade enzimática também foram avaliados utilizando substratos específicos. O uso de substratos e inibidores específicos mostrou uma forte evidência da presença da tripsina (BApNA = 0,51 ± 0,2 mU mg-1), quimotripsina (SAPNA = 2,62 ± 1,8 mU mg-1), e as aminopeptidases (Leu-p-Nan = 0,97 ± 0,83 mU mg-1) no intestino. O pH ótimo observado para a atividade de tripsina, quimotripsina, leucino aminopeptidase, amilase e pepsina foi 9,5, 9,0, 8,0, 7,5 e 3,5, respectivamente. A temperatura ótima observada foi 50, 50, 50, 40 e 45 °C, respectivamente. Estes resultados fornecem informações adicionais sobre a biologia do linguado brasileiro e pode ser usado como base para novos estudos sobre fisiologia alimentar.

Efeito do inibidor de proteinase de origem vegetal EcTI, sobre a inflamação pulmonar alérgica crônica em camundongos Balb/c / Effect of proteinase inhibitor of plant origin EcTI in an experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation in Balb/c mice

A prevalência de asma tem crescido e a maioria dos pacientes com asma grave não obtém o controle total dos sintomas com as terapias disponíveis, fazendo-se necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Inibidores de proteinases têm sido estudados como tratamento de processos inflamatórios, dentre eles o Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) OBJETIVO: Avaliar se o inibidor de proteinase EcTI modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Vinte e quatro camundongos Balb/c machos, entre seis e sete semanas de vida, pesando em media 25 g foram divididos em quatro grupos: C (controle), OVA (sensibilizados com ovalbumina, 50 ug intraperironeal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados nos dias 22, 24, 26, 28); C+EC (controle tratados com EcTI (2 mg/kg/i.p) nos dias 22 a 28); OVA+EC (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e também tratados com EcTI (2 mg/kg -i.p) nos dias 22 a 28). No dia 29, foram realizadas realizadas: (i) hiperresponsividade à metacolina e obtidas as respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; (ii) análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas (VA) e nos septos alveolares (SA); e (iii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de isoprostano nas VA e nos SA. Uma semana após o dia 29 foi realizada a técnica de anafilaxia cutanea passiva(PCA) para quantificar IgE e IgG1. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve aumento de todos os parâmetros avaliados no grupo OVA em relação ao grupo controle (p < 0,05). Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+EC comparado as grupo OVA (p < 0,05). O tratamento...

The number of cases of asthma has grown in recent decades. People who have severe asthma are likely to have more attacks and are at greater risk of a fatal attack, which propose to keep up global attention and keep approaching for advances in asthma care. Proteinase inhibitors of vegetable origin have been studied as a modulator of inflammatory responses and diseases. Among these inhibitors is Enterolobium contortisiliquum Trypsin Inhibitor (EcTI). AIMS: To evaluate the effects of EcTI in pulmonary mechanical, eosinophilic recruitment, inflammatory cytokines, remodeling of extracellular matrix and oxidative stressin an experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. METHODS: Twenty-four young adult male pathogen-free mice BALB/c (6-7 weeks old, 25-30g) were divided into 4 groups: C (control), OVA (sensitized with ovalbumin, 50 ug intraperitoneal (i.p), on days 0 and 14 and challenged with ova 1%, on days 22, 24, 26, 28); C+EC (control treated with EcTI- 2 mg/kg/i.p. from days 22 to 28); OVA+EC (sensitized and challenged with ovalbumin and treated with EcTI (2 mg/kg/i.p) from days 22 to 28). At day 29, we performed: (i) Bronchial hyperresponsiveness to methacholine and obtained the maximum response of resistance (Rrs) and elastance (Ers) of the respiratory system; (ii) lung histopathological analysis by morphometry to quantify eosinophils, collagen and elastic fibers volume fraction in airways; and (iii) immunohistochemistry to quantify IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-, iNOS, NF-kB positive cells and isoprostane volume fraction in airways. One week after the day 29 we performed PCA technique to quantify IgE and IgG1 antibodies. Significance was considered at p < 0.05. RESULTS: The EcTI treatment in the ovalbumin-sensitized animals attenuated the maximal response of resistance and elastance of respiratory system after methacholine, the number of eosinophils, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, NF-kB and iNOS-positive cells,...

Aislamiento de metapneumovirus humano (HMPV) a partir de muestras clínicas / Human metapneumovirus isolation using clinical respiratory samples

Objetivo: El objetivo de este trabajo fue establecer una metodología para el aislamiento de una cepa de hMPV a partir de hisopados nasales provenientes de pacientes con sintomatología de enfermedad respiratoria aguda. Materiales y métodos: A partir de 12 muestras positivas por fluorescencia para hMPV, se hizo la inoculación en células LLCMK2 (epiteliales de riñón de mono Rhesus) con un medio de mantenimiento que contenía tripsina como proteasa. Se evaluó el efecto citopático diario por 10 días y se tomaron células infectadas que se utilizaron para la prueba de fluorescencia y para confirmar la infección. Se utilizó RT-PCR para corroborar la presencia del virus. Resultados: En 8 de las 12 muestras procesadas, se logró aislar el hMPV, confirmándose la infección por fluorescencia y RT-PCR. Conclusiones: A pesar de ser un virus de crecimiento lento y difícil de aislar según los reportes, en este trabajo se logró aislar el hMPV a partir de muestras clínicas frescas, lo cual resulta de gran utilidad en futuros estudios sobre la patogénesis de la infección respiratoria.

Objective: The aim of this work was to establish a laboratory protocol to isolate human metapneumovirus (hMPV) using as a source confirmed respiratory secretion samples from symptomatic patients. Methods: Twelve respiratory secretion samples confirmed for hMPV by immunofluorescence were inoculated on LLCMK2 primate cells using trypsin to improve the virus binding. The cytopathic effect was evaluated during 10 days, then they were stained with an hMPV specific antibody and culture supernatants were used to detect viral RNA by RT-PCR. Results: We isolated hMPV in 8 out of 12 samples. Monkey cells were susceptible to infection and showed viral replication in both immunocytochemistry and molecular tests and even syncytia formation. Conclusion: Despite the hMPV has low replication rates in culture, causing difficulties to isolate it, in this work we accomplish the viral isolation in eight samples that had been previously confirmed containing hMPV. These clinical isolates are a useful tool to study the respiratory infection pathogenesis.

Microproteínas urinarias en diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos / Urinary microproteins in normoalbuminuric type 2 diabetic patients / Microproteínas urinárias em diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos

En pacientes diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos se observa la presencia de Microproteínas Urinarias (MU) en el rango 68-25 kDa. El objetivo del trabajo fue identificar en distintos estadios de la nefropatía diabética si dicho rango corresponde a un marcador de daño tubular. Se estudiaron 119 orinas espontáneas de pacientes diabéticos tipo 2; se les midió la relación albúmina/creatinina urinaria y la creatinina sérica. Se dividieron en 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urémicos en pre-diálisis y 6 en hemodiálisis. Las MU se detectaron en geles de poliacrilamida en 2 dimensiones para uso clínico y se analizaron con el programa Image J 1.30v. La identificación de las MU se realizó por “immunoblotting” o por espectrometría de masa MALDI-TOF-TOF. El 66% de los normoalbuminúricos presentaron las siguientes MU: orosomucoide, fragmento de 35 kDa de la cadena pesada H4 del inter alfa I inhibidor de tripsina y Beta Trace, las cuales no reflejaron daño tubular debido a que la concentración de las mismas no se incrementó en los pacientes en hemodiálisis, en comparación con los normoalbuminúricos. Dichas proteínas están vinculadas al endotelio vascular y podrían constituir un marcador urinario vascular-tubular renal de utilidad clínica en patologías sistémicas con riesgo cardiovascular y funcionalidad renal conservada.

Urinary excretion of microproteins (MU) was detected in normoalbuminuric type 2 diabetic patients, in the range of 68-25 kDa using SDS-PAGE with silver staining. The purpose of this study was to identify MU in diabetic patients in different grades of diabetic nephropathy, in order to clarify the diagnostic relevance as a marker of renal tubular damage. In the spontaneous urine of 119 type 2 diabetic patients, urinary albumin, urinary creatinine and serum were determined. Five groups were formed: 71 normoalbuminuric, 28 microalbuminuric, 12 macroalbuminuric, 2 in pre-dialysis and 6 in hemodialysis. The MU were separated by two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis for clinical use (2D UC) and were identified by immunoblotting or MALDI-TOF-TOF mass spectrometry and analyzed using Image J version 1.30v. Of the normoalbuminurics patients studied, 66% excreted the following MU: orosomucoid, 35 kDa fragment of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4) and Beta Trace; but their concentrations did not reflect tubular damage because they exhibited a progressive downregulation. These proteins are involved in vascular endothelium, and they could be a marker of renal tubular-microvascular disease that would be useful in systemic diseases with cardiovascular risk and with preserved renal function.

Em pacientes diabéticos tipo 2 “normoalbuminúricos” se observa a presença de microproteínas urinárias (MU) em um intervalo compreendido entre 68 e 25 kDa. O objetivo do trabalho é identificar em distintos estágios da nefropatia diabética se tal intervalo corresponde a um marcador de dano tubular. Foram estudadas 119 amostras de urina espontânea de pacientes diabéticos tipo 2; foi medida a reação albumina/creatinina urinária e a creatinina sérica. Dividiram-se em 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urêmicos pré-dialise e 6 em hemodiálise. Foram detectadas as MU em géis de poliacrilamida em duas dimensões para o uso clínico e analisadas com o programa Image J versão 1.30v. A identificação das MU foi realizada por “immunoblotting” ou por espectrometria de massa MALDI-TOF-TOF. 66% de normoalbuminúricos apresentaram as seguintes MU: orosomucoide, Fragmento de 35 kDa da cadeia pesada H4 do interalfa inibidor da tripsina e Beta Trace, as quais não mostraram dano tubular devido a que a concentração das mesmas não está aumentada nos pacientes em hemodiálise, em comparação com os normoalbuminúricos. Estas proteínas estão envolvidas com o endotélio vascular e poderiam constituir um marcador urinário vascular-tubular renal de utilidade clínica em patologias sistêmicas com risco cardiovascular e funcionalidade renal conservada.

Glyphosate on digestive enzymes activity in piava (Leporinus obtusidens) / Glifosato sobre a atividade de enzimas digestivas em piavas (Leporinus obtusidens)

The effects of glyphosate, a nonselective herbicide (1.0 or 5.0mg L-1) on digestive enzymes activity (stomach and intestine) were evaluated in juveniles of piava (Leporinus obtusidens) after 90 days of exposure. The activity of acid protease, trypsin, chymotrypsin and amylase increased with the increase of glyphosate concentration. These results indicate that glyphosate affects digestive enzyme activities in this species, and may be an indicator of poor nutrient availability when fish survive in herbicide-contaminated water.

Os efeitos do glifosato, um herbicida não seletivo (1,0 ou 5,0mg L-1), sobre a atividade de enzimas digestivas (estômago e intestino) foram avaliadas em juvenis de piava (Leporinus obtusidens) após 90 dias de exposição. A atividade da protease ácida, tripsina, quimiotripsina e amilase aumentaram com a elevação da concentração de glifosato. Esses resultados indicam que o glifosato afeta a atividade de enzimas digestivas nesta espécie e pode ser indicador da reduzida disponibilidade de nutrientes, quando peixes sobrevivem em água contaminada com este herbicida.

Actividad de las Enzimas Tripsina y Lipasa Pancreáticas en Cerdos Alimentados con Harina de Pijiguao (Bactris gasipaes H.B.K.) y Lisina Sintética / Trypsin and Lipase Pancreatic Enzymes Activity in Pigs Fed with Pijiguao Meal (Bactris gasipaes H.B.K.) and Synthetic Lysine

Para determinar la actividad de las enzimas tripsina y lipasa pancreática de cerdos alimentados con harina de pijiguao (Bactris gasipaes H.B.K., HP) y lisina sintética (LS), se diseñó un experimento con 48 cerdos castrados, con peso vivo promedio de 30 ± 0,5 kg, distribuidos al azar en seis diferentes dietas experimentales, con un arreglo factorial 3 x 2, con tres niveles de HP (0, 16 y 32 %), con o sin adición de 0,27% de LS; con cuatro repeticiones por dieta y dos cerdos por unidad experimental. Se sacrificaron cuatro cerdos por dieta en la tercera y sexta semana, para obtener muestras de páncreas. No se observó efecto de dieta (HPxLS) sobre la actividad de las enzimas, pero si hubo efecto (P<0,05) de la interacción dieta x semana sobre la actividad de la tripsina y lipasa. No hubo diferencias significativas en la actividad de la tripsina en la tercera semana después del consumo de las dietas. En la sexta semana todas las dietas, excepto la que contenía 0,27% LS y 16% HP, mostraron menor (P<0,05) actividad de la tripsina que la dieta basal. La actividad de la lipasa pancreática fue mayor (P<0,05) en los cerdos que consumieron la dieta con 32% HP sin LS en la tercera semana; y en la sexta semana, la actividad fue menor (P<0,05) en los cerdos cuyas dietas contenían 16% HP con y sin la adición de 0,27% LS, en comparación con la dieta basal y la que contenía 32% HP sin LS. En conclusión, la HP y/o LS en dietas para cerdos en crecimiento afecta la actividad de las enzimas tripsina y lipasa pancreáticas luego de la sexta semana de consumo.

An experiment was conducted to determine the activities of trypsin and lipase pancreatic enzymes from growing pigs fed peach palm meal (Bactris gasipaes H.B.K.; PPM) and synthetic lysine (SL). Forty-eight barrows, with an average live weight of 30 ± 0 5 kg, were randomly distributed and allotted to six experimental diets in a 3x2 factorial arrangement of treatments, with three levels of PPM (0, 16 and 32 %), with or without the addition of 0.27% SL, with four replications per diet and two pigs per experimental unit. To collect pancreas samples, four pigs per diet were slaughtered at third and sixth weeks. The results of the assay showed no effect of diet (PPM xLS) on the activity of the enzymes. An effect (P <0.05) of the diet x week interaction on trypsin and lipase enzymatic activities was observed. There were no significant differences in the activity of trypsin in the third week, after consumption of diets. In the sixth week, all diets, except that containing 0.27 % of SL and 16 % of PPM, showed lower (P<0.05) trypsin activity than the basal diet. In the third week, the pancreatic lipase activity was greatest (P<0.05) in pigs fed the diet with 16% of PPM without SL; and in the sixth week, the activity was less (P<0.05) in pigs fed diets containing 32% of PPM with and without the addition of 0.27% of SL, when compared with the basal diet and that which contained 32% of PPM and/or SL. In summary, the PPM and/or SL diets affect the trypsin and pancreatic lipase activities after sixth weeks of consumption.

Presença de inibidores de proteases em amostras comerciais de “faseolaminas” utilizadas como bloqueadores de carboidratos e os riscos à saúde / Occurrence of proteases inhibitors in commercial samples of “phaseolamins” used as carbohydrate blockers and the health risks

Foi investigada a veiculação de inibidores de proteases, concomitante ao consumo de “faseolamina”, cuja ingestão diária e de maneira prolongada poderia estar associada ao risco no desenvolvimento de alterações morfológicas e metabólicas de pâncreas. Dez amostras foram obtidas em farmácias de manipulação no município de Uberaba – MG, as quais são comercializadas na forma de cápsulas como “faseolamina”e uma como “farinha de feijão branco”, além de amostra de farinha preparada a partir da trituração de feijões brancos (Phaseolus vulgaris) obtidos comercialmente, sem qualquer processamento. Estas amostras foram analisadas efetuando-se a determinação de atividade de inibidores de tripsina, a determinação de proteínas totais e de atividade de inibição de amilase. Todas as amostras estudadas apresentaram atividades de inibição de tripsina, porém com baixa ou mesmo inexistente inibição de amilase; e em algumas amostras foi detectada concentração de proteínas muito inferior ao esperado. Uma vez observada a presença de atividade de inibição de tripsina em todas as amostras estudadas, e pela inexistência de níveis seguros de consumo estabelecidos para o ser humano, e ainda baseando-se nos trabalhos sobre associação de ingestão prolongada destes inibidores com alterações de atividade pancreática, o consumo destes “bloqueadores de carboidratos” deveria ser melhor controlado.

This study aimed at verifying the risk in developing the metabolic and morphological changes inpancreas, owing to the use of daily and prolonged consumption of protease inhibitors in conjunctionwith “phaseolamine”. Ten samples were obtained from drugstores in the city of Uberaba – MG, soldas “phaseolamine” and one known as “white bean flour”, and also one flour sample produced fromcommercial white beans (Phaseolus vulgaris) without any processing. These samples were analyzedby determining the activity of trypsin inhibitors, the total protein and the amylase inhibition activity.Trypsin inhibition activity was found in all of analyzed samples; however, the amylase inhibition activitywas low, and in some samples the protein concentration was much lower than expected. Seeing that thetrypsin inhibitory activity was detected in all of analyzed samples, and considering that the prolongedingestion of these inhibitors might cause activity changes in pancreas, the consumption of these types of“carbohydrate blockers” should be deeply discussed, since the safe amounts of these compounds have notbeen established for humans consumption yet.

Purification of a membrane-bound trypsin-like enzyme from the gut of the velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis Hübner) / Purificação de uma enzima "tipo tripsina" não-solúvel do intestino da lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis Hübner)

Disruption of protein digestion in insects by specific endoprotease inhibitors is being regarded as an alternative to conventional insecticides for pest control. To optimize the effectiveness of this strategy, the understanding of the endoprotease diversity of the target insect is crucial. In this sense, a membrane-bound trypsin-like enzyme from the gut of Anticarsia gemmatalis fifth-instar larvae was purified. Non-soluble fraction of the gut extract was solubilized with 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) and subjected to a p-aminobenzamidine affinity chromatography followed by anion-exchange chromatography. The yield of the purified enzyme was 11% with a purification factor of 143 and a final specific activity of 18.6 µM min.-1 mg-1 protein using N-α-benzoyl-L- Arg-p-nitroanilide (L-BApNA) as substrate. The purified sample showed a single band with proteolytic activity active and apparent molecular mass of 25 kDa on SDS-PAGE. Molecular mass determined by MALDI-TOF mass spectrometry was 28,632 ± 26 Da. Although the low recovery and the difficulties in purifying large enzyme amounts limited its further characterization, the results contribute for the understanding of the proteases present on A. gemmatalis gut, which are potential targets for natural or specifically designed protease inhibitors.

Comprometer a digestão de proteínas dos insetos pelo uso de inibidores específicos de endoproteases tem sido amplamente estudado como um método de controle de pragas alternativo ao uso dos inseticidas convencionais. No processo de otimização desta estratégia, o conhecimento da diversidade das endoproteases do inseto alvo torna-se crucial. Neste sentido, uma enzima "tipo-tripsina" ligada à membrana obtida do intestino de larvas do 5° instar de A. gemmatalis foi purificada. A fração insolúvel do extrato do intestino foi solubilizada com 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) e submetida à uma cromatografia de afinidade em uma coluna de p-aminobenzamidina, seguida por uma cromatografia de troca-aniônica. O rendimento da enzima purificada foi de 11% com fator de purificação de 143 e uma atividade específica final de 18.6 µM min.-1 mg-1 de proteína usando N-α-benzoyl-L- Arg-p-nitroanilide (L-BApNA) como substrato. Após a separação da amostra purificada por SDS-PAGE e incubação subsequente com caseína, uma única banda ativa com massa molecular aparente de 25 kDa foi observada. A massa molecular determinada por espectrometria de massa (MALDI-TOF) foi de 28,632 ± 26 Da. O baixo rendimento e as dificuldades em purificar grandes quantidades da enzima limitaram caracterização complementar. A observação desta enzima, no entanto, é mais uma etapa no processo de conhecer as endoproteases presentes no intestino de A. gemmatalis, alvos potenciais de inibidores de proteases naturais ou especificamente projetados.

Prospeção de inibidores de serinoproteinases em folhas de leguminosas arbóreas da floresta Amazônica / Prospecting serine proteinase inhibitors in leaves from leguminous trees of the Amazon forest

Os inibidores de proteinases são proteínas extensivamente investigadas nos tecidos de estocagem, mas pouco prospectadas em outros tecidos vegetais. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de inibidores de serinoproteinases em extratos foliares de quinze espécies de leguminosas arbóreas da Amazônia. As espécies estudadas foram: Caesalpinia echinata, C. ferrea, Cedrelinga cateniformis, Copaifera multijuga, Dinizia excelsa, Enterolobium contortisiliquum, E. maximum, E. schomburgkii, Leucaena leucocephala, Ormosia paraensis, Parkia multijuga, P. pendula, P. platycephala, Swartzia corrugata e S. polyphylla. Folhas foram coletadas, secas a 30ºC durante 48 h, trituradas e submetidas à extração com NaCl (0,15 M, 10 por cento p/v) resultando no extrato total. Ensaios foram executados para determinar a concentração de proteínas e detectar a atividade inibitória contra a tripsina e quimotripsina bovina. Os teores de proteínas bruta e solúvel nos extratos foliares variaram de 7,9 a 31,2 por cento e 1,3 a 14,8 por cento, respectivamente. A atividade inibitória sobre a tripsina e quimotripsina foi observada em todos os extratos foliares. Contudo, nos extratos de E. maximum, L. leucocephala, P. pendula, S. corrugata e S. polyphylla a inibição foi maior sobre a tripsina, enquanto o extrato de P. multijuga foi mais efetivo contra a quimotripsina. Nós concluímos que nos extratos foliares de leguminosas arbóreas têm inibidores de serinoproteinases e exibem potencial aplicações biotecnológicas.

The proteinase inhibitors are proteins extensively investigated in tissue storage, but few prospected in other plant tissues. The aim of this study was to detect the presence of serine proteinase inhibitors in leaf extracts from fifteen species of leguminous trees of the Amazon forest. The species studied were Caesalpinia echinata, C. ferrea, Cedrelinga cateniformis, Copaifera multijuga, Dinizia excelsa, Enterolobium contortisiliquum, E. maximum, E. schomburgkii, Leucaena leucocephala, Ormosia paraensis, Parkia multijuga, P. pendula, P. platycephala, Swartzia corrugata and S. polyphylla. Leaves were collected, dried at 30ºC for 48 h, crushed and subjected to extraction with NaCl (0.15 M, 10 percent w/v), resulting in the total extract. Tests were performed to determine the concentration of proteins and to detect of inhibitory activity against bovine trypsin and chymotrypsin. The content of crude and soluble protein in leaf extracts varied from 7.9 to 31.2 percent and 1.3 to 14.8 percent, respectively. The inhibitory activity on trypsin and chymotrypsin was observed in all leaf extracts. However, in extracts of E. maximum, L. leucocephala, P. pendula, S. corrugata and S. polyphylla, the inhibition was greater on trypsin, while extract of P. multijuga was more effective against chymotrypsin. We conclude that leaf extracts of leguminous trees have serine proteinase inhibitors and show potential biotecnological applications.

Efeito do tratamento sob alta pressão isostática sobre os teores de fitato e inibidor de tripsina de soja / Efect of tratment isostatic high pressure on phytate and trypsin inhibitors soybean

A soja constitui excelente fonte de proteína para a alimentação humana e animal, porém contém alguns componentes de ação antinutricional, como os inibidores de proteases, lectinas, fitatos e saponinas. Neste trabalho foram avaliados os efeitos do tratamento sob alta pressão isostática,considerado brando em relação ao tratamento térmico, sobre os fatores antinutricionais como teor de fitato e inibidor de tripsina de solução com 5% de isolado proteico de soja, processada na faixa de 200 a 700 MPa. Foram realizadas duas extrações de fitato e inibidor de tripsina de bateladas diferentes, sendo as amostras analisadas em triplicata. Há indícios que o tratamento sob alta pressão isostática seja eficiente para eliminar o fitato presente nas amostras de isolado proteico de soja, mas não se mostrou efetivo para alterar os teores de inibidor de tripsina.

Production of cuticle-degrading proteases by Nomuraea rileyi and its virulence against Anticarsia gemmatalis / Produção de proteases degradadoras de cutícula por Nomuraea rileyi e sua virulência contra Anticarsia gemmatalis

Nomuraea rileyi represents an important natural control agent of Anticarsia gemmatalis preventing populations from reaching economic threshold levels in soybean. During the processes of host infection, entomopathogenic fungi produce extracellular proteases, which degrade the host cuticle and are suggested to be virulence determinants. It was examined the production of subtilisin-like (Pr1) and trypsin-like (Pr2) proteases in two strains (NR458 and CG434) of N. rileyi and its possible role in the process of pathogenicity to this caterpillar. Fungal growth was performed in a mineral medium containing nitrate, and supplemented with the cuticle or exuviae from A. gemmatalis, or with the non-cuticular substrate casein. In medium containing nitrate as sole nitrogen source, no detectable Pr1-like activity occurred in the culture supernatants of the two fungal strains. However, both strains of N. rileyi produced Pr1-like protease in all medium amended with exogenous nitrogen source, and it was highly expressed in the presence of insect cuticle. Pr2-like activity was significantly inferior to Pr1-like activity and it was detected only in some of the media culture and incubation periods tested. In the NR458 culture supernatant the highest activity was observed in medium containing nitrate as nitrogen source. Correlation analysis between the percentage of A. gemmatalis mortality in bioassays and Pr1-like protease activity of strain NR458 suggests a positive correlation for these variables.

O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de proteases dos tipos subtilisina [Pr1] e tripsina [Pr2] por duas linhagens do fungo entomopatogênico Nomuraea rileyi e a correlação entre a atividade de Pr1 e a patogenicidade contra Anticarsia gemmatalis. O crescimento do fungo foi realizado em meio mínimo contendo nitrato e suplementado com a cutícula ou exúvia de A. gemmatalis, ou com substrato não cuticular caseína. Em meio contendo nitrato, nenhuma atividade de Pr1 foi detectada nos sobrenadantes das culturas. Entretanto, as duas linhagens de N. rileyi produziram Pr1 em meio suplementado com fonte exógena de nitrogênio, e alta atividade foi verificada na presença da cutícula do inseto. A atividade de Pr2 foi inferior à atividade de Pr1. A análise de correlação entre a atividade de Pr1 da linhagem NR458 e mortalidade de A. gemmatalis sugere uma correlação positiva para essas variáveis. A avaliação da atividade de enzimas em diferentes condições pode ajudar na compreensão do processo infeccioso de N. rileyi em A. gemmatalis.

Inibição da tripsina de bicho-mineiro do cafeeiro por um fator não-protéico presente em extratos de folhas de mamona / Coffee leaf miner trypsin inhibition with castor bean leaf extracts mediated by a non-protein agent

Inibidores de tripsina representam uma estratégia de controle de insetos e, por isso, a identificação e caracterização desses inibidores são etapas muito importantes para que novas formas de controle de pragas sejam desenvolvidas. Os inibidores de tripsina atuam na digestão primária de proteínas e comprometem o processo digestivo por completo, reduzindo a disponibilidade de aminoácidos ao inseto. A incorporação de inibidores de tripsina na dieta de insetos-praga é uma forma de controle cuja eficácia foi verificada por diferentes autores. Este projeto foi conduzido a fim de se observar a eficiência de extratos de folhas de mamona na inibição "in vitro" de proteinases do tipo tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro. Após testes realizados com os extratos de folhas de mamona não-fervidos e fervidos com e sem a adição de β-mercaptoetanol 0,2 por cento (v/v) e mediante precipitações com acetona, verificou-se que o inibidor é uma molécula termoresistente e não-protéica. Desta forma, iniciou-se um processo de purificação da molécula inibidora por meio de cromatografia de adsorção com posterior análise em espectrômetro de massas. Os resultados dos testes de inibição indicaram a presença de um inibidor de tripsina eficaz contra o bicho-mineiro do cafeeiro nos extratos de folhas de mamona capaz de inibir 2,48 + 0,15 UTI, o que representa aproximadamente 40 por cento de inibição. Em testes realizados com tripsina bovina observou-se que o extrato de folhas de mamona não apresenta poder de inibição sobre essa enzima.

Trypsin inhibitors stand for a strategy of insect control and, therefore, the identification and characterization of these inhibitors are very important steps for new forms of pest control to be developed. Trypsin inhibitors act in the primary digestion of proteins and endanger the digestive process wholly, reducing the availability of aminoacids to the insect. The incorporation of trypsin inhibitors in the diet of pest insects is a control form whose efficacy was verified by different authors. In order to observe the efficiency of castor bean leaf extracts in inhibiting trypsin-like enzymes of the coffee leaf miner, an experiment was carried out with the purpose of observing an "in vitro" inhibition phenomenon. The results of the trypsin inhibition tests with normal and boiled with and without β-mercaptoethanol 0.2 percent (v/v) castor bean leaf extracts and the results of the acetone precipitation process indicated that the inhibitor is a heat-resistant molecule and it is not a protein. This way, the purification process was made by adsorption chromatography with later analysis in mass spectrometer. The reached results indicated that the presence of a trypsin inhibitor of the coffee leaf miner in the castor bean leaf extracts is capable of inhibiting 2.48 + 0.15 UTI, which stands for about 40 percent of inhibition. Tests performed with bovine trypsin indicated that the castor bean leaf extract have no inhibiting power on this enzyme.

Action of plant proteinase inhibitors on enzymes of physiopathological importance

Obtained from leguminous seeds, various plant proteins inhibit animal proteinases, including human, and can be considered for the development of compounds with biological activity. Inhibitors from the Bowman-Birk and plant Kunitz-type family have been characterized by proteinase specificity, primary structure and reactive site. Our group mostly studies the genus Bauhinia, mainly the species bauhinioides, rufa, ungulata and variegata. In some species, more than one inhibitor was characterized, exhibiting different properties. Although proteins from this group share high structural similarity, they present differences in proteinase inhibition, explored in studies using diverse biological models.

Obtidas de sementes leguminosas, várias proteínas inibem proteinases de origem animal, incluindo humanas, e podem ser consideradas para o desenvolvimento de compostos com atividade biológica. Inibidores da família Bowman-Birk e da família Kunitz vegetal tem sido caracterizados em relação a especificidade para proteinase, estrutura primária e sitio reativo. O nosso grupo majoritariamente vem estudando o gênero Bauhinia, principalmente as espécies bauhinioides, rufa, ungulatae variegata. Em algumas espécies, mais de um inibidor com propriedades diferentes foi caracterizado. Embora tais proteínas apresentem alta similaridade estrutural, diferem quanto à inibição de proteinases, e foram exploradas em estudos utilizando diversos modelos biológicos.